Hari ini, mari kita bicara tentang masalah yang telah menyebabkan banyak sakit kepala rekan penelitian - Western Blot (WB). Eksperimen "perangkap" yang tampaknya sederhana tetapi penuh ini, mengapa itu selalu membuat kita tersandung lagi dan lagi? Sekarang mari kita tinjau alasan kegagalan bersama.
I. Tidak ada band
Alasan yang mungkin termasuk:
- Masalah antibodi: Antibodi mungkin tidak efektif, tidak spesifik, atau tidak mengikat protein target.
- Masalah sampel: Sampel mungkin mengandung zat yang mengganggu, terlalu rendah dalam konsentrasi, atau sudah terdegradasi.
- Masalah elektroforesis: Kondisi elektroforesis yang tidak tepat, seperti tegangan, waktu, atau penggunaan buffer yang tidak tepat.
- Masalah transfer: Masalah selama proses transfer, seperti pemilihan membran yang tidak tepat, waktu transfer, atau buffer transfer.
- Masalah pemblokiran: Solusi pemblokiran mungkin tidak tepat atau waktu pemblokiran mungkin terlalu lama.
- Masalah pewarnaan: Reagen pewarnaan mungkin kedaluwarsa, tidak sensitif, atau tidak digunakan secara tidak tepat.
Masalah Peralatan: Peralatan dapat tidak berfungsi atau tidak dikalibrasi dengan benar.
- Masalah Operasi Eksperimental: Operasi eksperimental mungkin tidak distandarisasi, seperti pencucian yang tidak memadai atau pemuatan sampel yang tidak merata.
- Masalah Modifikasi Protein: Protein target dapat menjalani modifikasi pasca-translasi yang mencegah pengenalan antibodi.
- Masalah Ekspresi Protein Target: Protein target mungkin memiliki ekspresi yang sangat rendah atau tidak ada ekspresi dalam sel atau jaringan yang terdeteksi.
Ii. Latar belakang tinggi
Alasan yang mungkin termasuk:
- Konsentrasi antibodi tinggi: Menggunakan terlalu banyak antibodi dapat meningkatkan pengikatan spesifik, menghasilkan latar belakang yang tinggi.
- Masalah Kualitas Antibodi: Antibodi mungkin memiliki ikatan yang tidak spesifik atau bereaksi silang dengan protein lain.
- Pemblokiran yang tidak mencukupi: Solusi pemblokiran gagal untuk secara efektif menutupi situs pengikatan spesifik pada membran, menghasilkan latar belakang yang tinggi.
- Masalah membran: Membran mungkin memiliki kualitas atau kontaminasi yang buruk, yang mengarah ke latar belakang yang tinggi.
- Transfer Tidak Lengkap: Selama proses transfer, protein mungkin tidak sepenuhnya ditransfer ke membran, menghasilkan latar belakang yang tinggi.
- Cuci yang tidak mencukupi: Langkah -langkah pencucian gagal menghilangkan antibodi yang tidak terikat secara efektif atau kotoran lainnya, yang mengarah ke latar belakang yang tinggi.
- Pewarnaan masalah reagen: Reagen pewarnaan mungkin terlalu sensitif atau tidak stabil, menghasilkan latar belakang yang tinggi.
- Masalah Peralatan Eksperimental: Peralatan mungkin mengalami kebocoran atau gangguan, yang mengarah ke latar belakang tinggi.
- Masalah Sampel Protein: Sampel dapat mengandung sejumlah besar zat yang mengganggu, seperti produk degradasi protein atau kotoran lainnya.
- Masalah Operasi Eksperimental: Operasi eksperimental mungkin tidak distandarisasi, seperti waktu inkubasi yang berkepanjangan atau suhu tinggi.
AKU AKU AKU. Pita tidak spesifik atau ukuran pita protein yang salah
Alasan yang mungkin termasuk:
- Terlalu banyak bagian sel, menghasilkan tingkat ekspresi protein yang berbeda, yang mengarah ke ukuran pita yang tidak konsisten atau adanya beberapa pita.
- Degradasi sampel protein, menghasilkan berat molekul protein yang lebih rendah atau adanya beberapa pita.
- Sampel protein yang diekspresikan secara in vivo dapat memiliki berbagai bentuk modifikasi seperti asetilasi, metilasi, alkilasi, fosforilasi, dan glikosilasi, yang mengarah ke ukuran pita yang tidak konsisten atau adanya beberapa pita.
- Protein target mengandung beberapa isoform atau varian sambatan, menghasilkan ukuran pita yang tidak konsisten atau adanya beberapa pita.
